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免疫印迹(Western Blot)的根基道理、尝试步骤及FAQ

检查Western blot尝试题目:Western Blot的罕见题目(FAQ)

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Western Blot道理

接纳的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是卵白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对卵白质样品停止分手,转移到固相载体——比方硝酸纤维素薄膜(NC)上。固相载体能够吸附卵白质,并坚持电泳分手的多肽范例及其生物学活性稳定。转移后的NC膜就称为一个印迹(blot),用卵白溶液(如5%BSA或脱脂奶粉溶液)处置,封锁NC膜上的疏水连系位点。用方针卵白的抗体(一抗)处置NC膜——只要待研讨的卵白质能力与一抗特异连系构成抗原抗体复合物,如许洗濯撤除未连系的一抗后,只要在方针卵白的地位上连系着一抗。用一抗处置过的NC膜再用标记的二抗处置,二抗是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中取得的,则二抗便是抗鼠IgG的抗体。处置后,带有标记的二抗与一抗连系构成抗体复合物能够唆使一抗的地位,便是待研讨的卵白质的地位。

Western Blot尝试试剂及仪器

1.试剂筹办
(1)甲醇
(2)转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L)
(3)一抗,二抗
(4)PBST,PBS,Tween-20
(5)显影液(5X):
自来水(加热至 50℃) 375ml (以下药品加到温水中)
米吐尔 1.55g, 亚硫酸钠(无水) 22.5g, 碳酸钠(无水) 33.75g, 溴化钾 20.95g,补水至 500ml
(6)定影液:
自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按挨次插手前者消融后再加后者)
硫代硫酸钠 240g, 亚硫酸钠(无水) 15g, 冰乙酸 12.6ml,硼酸 7.5g,钾明矾 15g(水温冷至 30℃以下时再插手),加水定容至 1000ml,室温保管
2. 材料筹办
转膜用的夹子,两块海绵垫,一支滴管,两张滤纸,一张PVDF膜,转膜槽,转移电泳仪,摇床,计时器,磁力搅拌器,转子,Western blot 盒,一块SDS-PAGE胶,脱脂奶粉

尝试步骤

免疫印迹(Western Blot)的尝试步骤

(一) 配胶

  1. 将玻璃板洗净,最初用ddH2O冲刷,将与胶打仗的一面向下倾斜置于清洁的纸巾晾干。
  2. 分手胶及浓缩胶都可事前配好(除AP及TEMED外),过滤后作为贮存液避光寄存于4℃,可最少寄存1个月,临用前掏出室温均衡(不然凝胶进程发生的热量会使高温时消融于贮存液中的气体析出而致使气泡),插手10%AP及TEMED便可。
  3. 封胶:注重灌输2/3的分手胶后应当即封胶,胶浓度<10%时可用0.1%的SDS封,浓度>10%时用异丁醇或异戊醇,也能够用0.1%的SDS,封胶后静置至胶凝结。待胶凝后将封胶液倒掉,如用醇封胶需用大批净水及ddH2O冲刷清洁,而后加少许0.1%的SDS,目标是经由进程下降张力断根残留水点。
  4. 灌好浓缩胶后1h废除梳子,注重在废除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲刷胶孔两遍以去除残胶,随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形,可用恰当粗细的针头拨正。30min后上样,永劫间有益于胶布局的构成,由于肉眼观的胶凝时其外部份子的摆列还不实现。(10%的AP最好现配现用,如在4℃寄存勿跨越两周。30%的丙烯酰胺若有积淀,最好弃掉)

(二) 样品处置

培育的细胞(定性)

  1. 去培育液后用温的PBS冲刷2~3遍(冷的PBS有能够使细胞零落)。
  2. 对6孔板来讲每孔加200~300uL,60~80℃的1×loading buffer。
  3. 刮下的细胞在EP管中煮沸10min,时代vortex 2~3次。
  4. 用清洁的针尖挑丝,将团块弃掉,若是不团块但有拉丝景象,可将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min,再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些黏稠,可利用1ml打针器频频抽吸来下降溶液粘滞度,便于上样。
  5. 待样品规复到室温后上样。

培育的细胞(定量)

  1. 去培育液后用温的PBS冲刷2~3遍(冷的PBS有能够使细胞零落)。
  2. 插手恰当的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
  3. 刮下的细胞搜集在EP管后超声(100~200w)3s,2次。
  4. 12000g离心,4℃,2min。
  5. 取少许上清停止定量。
  6. 将一切卵白样品调至等浓度,充实夹杂积淀后加loading buffer后间接上样最好,残剩溶液(溶于1×loading buffer)能够高温贮存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃ 1~2天,每次上样前98℃,3min。

3. 构造

  1. 心肝脾肾等构造可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注重尽可能坚持高温,疾速匀浆。
  2. 12000g离心,4℃,2min。
  3. 取少许上清停止定量。
  4. 将一切卵白样品调至等浓度,充实夹杂积淀加loading buffer后间接上样最好,高温贮存残剩溶液(溶于1×loading buffer),每次上样前98℃,3min。

(三)SDS-PAGE电泳(不必染色!)

使待测样品中的卵白质按份子量巨细在凝胶中分红带。对SDS-PAGE尝试操纵道理及FAQ参考SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

(四) 转膜

免疫印迹(Western Blot)的转膜进程
电泳竣事前20分钟摆布戴上手套起头筹办

1、筹办:转移缓冲液(Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L)、转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张PVDF膜。

2、剪切滤纸和膜时必然要戴一次性PE手套,防止手上的卵白净化膜。转膜前,PVDF膜应在甲醇溶液中浸泡5-10秒,浸润为止,在均衡液中均衡(甲醇的感化是牢固大份子卵白,使小份子物资易转移进来)

3、将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支滴管、2张滤纸、一张PVDF膜浸泡在转移缓冲液中,而后掏出SDS-PAGE胶,将浓缩胶悄悄刮去,并在胶的一角做一缺角作为标记以辨别上样挨次。将胶在转膜缓冲液中浸泡5min摆布,以均衡离子强度。

4、夹子翻开平放底部玄色电极(阴极),放一张海绵垫片,用玻棒往返擀几遍以擀走外面的气泡。在海绵垫片上安排1张转移缓冲液浸泡过的滤纸,对齐,而后用一玻璃棒作滚筒以挤出一切气泡,须要时可滴加转膜液润湿。掏出浸在转膜液中的凝胶平放在滤纸上,解除一切气泡。将PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝胶上,玻棒往返擀几遍解除一切气泡,注重在膜的正面作上标记(能够将膜的一角剪去或用具名笔在膜的边角上做暗号)。在膜上盖一张转移缓冲液浸泡过的滤纸,一样须确保不留气泡。最初盖上另一张海绵垫,盖上阳极板(红色),夹紧。保障对凝胶有必然压力。

5、将夹子放入转移槽中,要使夹的黑面临槽的黑面,夹的白面临槽的红面。转膜时将转移槽放入冰水中停止。转膜进程中电转液用磁力搅拌器搅拌。普通用恒压110V转移60min。对大份子量的卵白(跨越120KD),时候约80min。出格要注重增强降温办法。

(五) 免疫学检测

1、取膜,将膜正面朝上在1xPBST溶液中动摇五分钟,洗一次,移至含有封锁液(含10%脱脂奶粉的 瓶PBST 缓冲液;脱脂奶粉5g,PBST 100ml,消融后 4℃保管。利用时,规复室温,用量以盖过膜面便可,一次性利用。)的平皿中,室温下脱色摇床上动摇封锁1小时。注:10%脱脂牛奶的感化:用大份子物资封锁非相干的卵白连系位点,下降非特同性连系(抗体与膜),同时也使背风景不高。PBST:T为吐温,削减非特同性吸附,不影响抗体抗原的连系。
2、掏出膜在1xPBST溶液中洗5分钟,动摇,洗两次,放入1xPBST缓冲液中(内含5%脱脂牛奶),同时插手一抗与二抗到缓冲液中,孵育60min。
3、用1xPBST洗最少三次,5min/次
4、化学发光,显影。显影液与水1:4,定影液与水1:9,发光液
注:显影液(5X):
自来水(加热至 50℃) 375ml (以下药品加到温水中)
米吐尔 1.55g
亚硫酸钠(无水) 22.5g
碳酸钠(无水) 33.75g
溴化钾 20.95g
补水至 500ml
配制时,上述药品应一一插手,待一种试剂消融后,再插手后一种试剂。4℃保管。利用时
用自来水浓缩至 1 倍。
定影液:
自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按挨次插手前者消融后再加后者)
硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠(无水) 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g(水温冷至 30℃以下时再插手)
加水定容至 1000ml,室温保管
发光液:鲁米诺试剂2ml、过氧化氢1.3ml
5、在暗室中,将 1×显影液(50ml)和定影液(50ml)别离倒入塑料盒中;在红灯下掏出 X-光片,用切纸刀剪裁恰当巨细(比膜的长和宽均需大 1cm);翻开 X-光片夹,将膜放入X-光片夹,并将发光液平均涂抹在膜上,以后把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能挪动,翻开 X-光片夹,起头计时;按照旌旗灯号的强弱恰当调剂暴光时候,普通为 1min 或 5min,也可挑选差别时候屡次压片,以达最好成果;暴光实现后,翻开 X-光片夹,掏出 X-光片,敏捷浸入显影液中显影,待呈现较着条带后,顿时停止显影。显影时候普通为 1~2min(20~25℃),温度太低时(低于 16℃)需恰当耽误显影时候;显影竣事后,顿时把 X-光片浸入定影液中,定影时候普通为 5~10min,以胶片通明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。

(六)注重事变

1.显影和定影需挪动胶片时,尽可能拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,不然会对成果发生影响。
2.一抗,二抗的孵育时候因抗体差别可做恰当的调剂。
3.转膜时滤纸与胶,胶与膜,膜与滤纸之间不能有气泡,必须用玻棒擀走。有气泡会影响转膜成果。
4.把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能挪动

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