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免疫共积淀概述

相干办事:Co-IP卵白互作检测办事
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免疫共积淀(Co-IP)是操纵抗原与抗体之间的专注性感化为根本,用于研讨卵白质与卵白质之间彼此感化的典范体例。操纵能够或许检测两个已知卵白之间的彼此感化,或操纵已知卵白寻觅与之彼此感化的未知卵白。相较于其余份子间彼此感化检测体例(GST pull down等),免疫共积淀尝试的上风在于卵白的连系在细胞内实现,能够或许反映自然状况下的卵白质彼此感化,成果加倍实在靠得住。

尝试道理

免疫共积淀道理

当细胞在非变性前提下被裂解时,完全细胞内存在的良多卵白质-卵白质彼此感化被保留了上去,假定细胞内存在XY卵白复合物,用X(X也称为钓饵卵白)的抗体免疫积淀X,那末与X在体内连系的卵白质Y(Y也称为靶卵白)也被积淀上去。是以在细胞裂解液中插手X的抗体积淀卵白X,随后操纵卵白印迹(western blot,WB)检测积淀中是不是存在卵白Y,若是存在,则申明细胞内存在XY卵白复合物,即卵白XY存在彼此感化。

Co-IP尝试流程

免疫共积淀尝试流程为:搜集卵白样品—钓饵卵白抗体积淀钓饵卵白—SDS-PAGE分手卵白—WB检测是不是存在靶卵白。具体尝试操纵流程请至“免疫共积淀尝试操纵流程及注重事变”检查。
免疫共积淀尝试道理

搜集卵白样品

卵白样品凡是经由进程裂解细胞取得。Co-IP尝试凡是有两种,一种为内源性卵白彼此感化考证,别的一种为非内源性卵白彼此感化考证,内源性彼此感化是指两卵白彼此感化在细胞内发生,即经由进程质粒共转染的体例将两种卵白转染至统一细胞内抒发,抒发实现后搜集细胞停止裂解取得卵白样品。非内源性彼此感化两卵白彼此感化在细胞外发生,行将含有靶卵白的动植物构造、器官停止预处置及细胞裂解取得细胞裂解液,随后将钓饵卵白(凡是为重组抒发纯化取得)插手细胞裂解液中,取得卵白样品。

积淀钓饵卵白

操纵磁珠偶联抗体积淀钓饵卵白:在样品中插手磁珠偶联抗体,抗体会与钓饵卵白连系,操纵磁铁将磁珠拉下,同时钓饵卵白会一路被积淀出来。若是存在与钓饵卵白的彼此感化的靶卵白,也会被积淀上去。若是不钓饵卵白的特同性抗体,能够或许给钓饵卵白加上标签(Myc、HA、Flag等),而后操纵标签抗体积淀卵白。

SDS-PAGE及WB检测

取得积淀后,须要考证积淀中是不是存在彼此感化卵白。先操纵SDS-PAGE将卵白复合物分手,随后操纵WB检测是不是存在靶卵白(若是靶卵白的份子量是已知的,能够或许间接用SDS-PAGE检测是不是存在靶卵白)。

尝试对比设置

为了确保终究取得的成果是自然状况下的彼此感化,而不是由于某些方面形成的野生彼此感化(也便是“假阳性”),在Co-IP的尝试设想进程中,须要设置准确的对比。
假定Co-IP尝试的尝试组为“磁珠+抗X抗体+靶卵白X+方针卵白Y”,则能够呈现的“假阳性”及对应须要设置的尝试对比以下表所示:

能够呈现的“假阳性” 须要设置的对比尝试
磁珠与卵白X非特同性连系 “磁珠+抗体X+抗体Y”
磁珠与卵白Y非特同性连系 “磁珠+卵白Y”
抗X抗体和Y非特同性连系 “磁珠+抗体X+卵白Y”
抗X抗体(或磁珠)会和细胞裂解液内别的卵白连系 “磁珠+抗体X+未转染质粒的宿主细胞裂解液”
抗体的非特同性连系 “normal IgG+卵白X+卵白Y”

上述为了防止呈现“假阳性”的对比称为阳性对比,除此以外Co-IP尝试还会设置一个阳性对比组(Input组),Input组为间接操纵抗体X(抗体Y)对细胞裂解液停止WB检测,考证细胞裂解液中存在卵白X(抗体Y)。
在某些Co-IP尝试中,尝试职员会把IP后的上清别离停止卵白X和卵白Y的WB检测,该对比组称为output组。
操纵内源性Co-IP尝试为考证两个卵白是不是存在已知感化,若是终究的成果为阳性,则能够或许证明两个卵白之间存在彼此感化;但若是成果为阳性,没法证明两个卵白之间不存在彼此感化,也有能够是卵白在细胞内抒发量高等缘由致使。是以在停止内源性Co-IP考证两个卵白是不是存在彼此感化时,倡议先做过抒发Co-IP作为对比。

免疫共积淀成果实在性

在免疫共积淀尝试中要保证尝试成果的实在性,应注重以下几点:

  • 确保共积淀的卵白是由所插手的抗体积淀取得的,而并非外源非特异卵白,单克隆抗体具备特同性强、可大批出产、易规范化等长处,利用单克隆抗体有助于防止净化的发生;
  • 要确保抗体的特同性,若是抗体不能和细胞消融物中的抗原连系,则不会引发共积淀反映;
  • 肯定卵白间的彼此感化是发生在细胞中,而不是由于细胞的消融才发生的。

免疫共积淀手艺操纵

免疫共积淀尝试能够或许用于:

  • 测定两种方针卵白质是不是在体内连系
  • 肯定一种特定卵白质的新的感化同伴
  • 分手取得自然状况的彼此感化卵白复合物

跟着对卵白质研讨的不时深切,人们将免疫积淀体例与其余体例连系起来,在其根本上衍生出良多较为庞杂的手艺,从而使得阐发体例更加多样化,它的操纵规模也相称的遍及。免疫共积淀是用来研讨卵白质与卵白质彼此感化的一种手艺,能够或许操纵于卵白复合物的研讨。它可考证卵白复合物的存在,进而发明新的卵白复合物;免疫共积淀手艺与免疫印迹法或质谱等体例连系,用于肯定钓饵卵白-方针卵白在自然状况下的连系环境,肯定特定卵白质的新感化同伴。免疫共积淀尝试也能够或许操纵于低品貌卵白的富集和稀释。
同时免疫共积淀手艺是一个绝对比拟典范的切磋卵白质间彼此感化的手艺,在古代医学研讨中操纵规模遍及且可托度较高。卵白质之间彼此感化渗入于机体每个细胞的性命勾当进程中,生物学中会呈现良多景象如复制、转录、翻译、剪切、排泄、细胞周期调控、旌旗灯号传导和中心代谢等都遭到卵白质间彼此感化的调控。有些卵白质由多个亚单元构成,卵白质之间的彼此感化就显得尤其遍及。又有些卵白质连系得非常慎密;而有些卵白质却只要长久的彼此感化。但是不管呈现哪些种环境,它们都节制着大批的细胞性命勾当的事务,比方细胞的增殖、分解和灭亡。且经由进程卵白质之间的彼此感化,能转变细胞内卵白质的能源学特点,比方底物连系特征、催化活性,也能够或许发生新的连系位点,对转变卵白质对底物的特同性有感化,还能够或许使其余卵白质失活,其余基因抒发取得调控。是以,只要让卵白质之间彼此感化得以顺遂停止,细胞的一般性命勾当进程才会取得保证。由于卵白质之间彼此感化具备如斯严重的意思,以是它的检测体例的研讨也备受存眷与正视。自此今后卵白彼此干系的研讨会愈演愈烈,将来不只仅能够或许经由进程免疫共积淀手艺来证明,还将会有愈来愈多的进步前辈手艺值得去操纵和成长。

其余彼此感化检测体例

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