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大肠杆菌抒发尝试规范操纵流程(SOP)

尝试道理和目标

道理:将外源基因拔出质粒或其余载体,再导入活的宿主细胞,使外源基因高效抒发,取得所需的卵白质。大肠杆菌卵白抒发道理及IPTG引诱道理具体内容请拜候:原核抒发IPTG引诱道理。
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尝试试剂

  • 质粒
  • 感触感染态细胞
  • TE:10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0
  • LB:试管4ml;固体平板
  • 抗性:A+(100mg/ml);   K+(50mg/ml);  CI
  • 保种甘油:C=80%   V=100ml
  • IPTG
  • 1 x PBS
  • 2 x Loading Buffer
  • DDH2O

尝试仪器

  • 冰箱(4℃)
  • 超高温冰箱(-80℃)
  • 水浴锅(42℃)
  • 摇床(37℃;195r)
  • 培育箱(37℃)
  • 可见分光光度计(OD600;OD=0.6-0.8)
  • 离心计心情(6000r/min)
  • 煮样器(100℃;25min)

具体尝试步骤

  1. 抒发判定第一天的使命,经常使用抗性挑选按照感触感染态细胞挑选
  • 拿到质粒,离心(3000r/min;2min)
  • 在质粒中插手TE【使质粒终究插手到110μL感触感染态细胞中的量为80-100ng,据此肯定插手TE的量】,普通为(1μg质粒加20μLTE;2μg质粒加50μLTE;5μg质粒加100μL TE)
  • 将质粒与TE混匀,吸收2μL混液与感触感染态细胞混匀
  • 将感触感染态细胞放入冰箱(4℃)中,30min
  • 掏出后当即放入水浴锅中(42℃),热激90s,
  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
  • 拿出后取200μL的LB液体培育基插手到已转入质粒的感触感染态细胞中
  • 放入摇床(37℃;  195r) 中,  30nim至60min; (最好45min)
  • 掏出离心(3000r/min;2min)
  • 去掉200μL的上清,留100μL摆布上清悬浮积淀,吸收50μL悬液涂平板,【先将对应抗性的平板放入培育箱(37℃)中预热20min】
  • 把平板放入培育箱(37℃),留宿(12h至16h)

2.  抒发判定第二天的使命,注重Pcold抒发载体的抒发温度

  • 每一个平板挑取单菌落至4支对应抗性的LB(4ml)试管中,编号为“0”“1”“2”“3”
  • 将试管放入摇床(37℃;195r) 中,【单抗性3h摆布;双抗性4摆布;刚起头用可见分光光度计测OD值;谙练后可目测(背光下,以试管中的枪头为例,方才看不见枪头便可)】,测OD值(0.6至0.8)
  • 从“0”号管中取700μL悬液插手到100μL(C=80%)的保种甘油中,震匀,放入冰箱(-20℃)冻存
  • 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中别离插手2μL的IPTG【终浓度0.5mM最适,可按照往后抒发试探】
  • 视差别的载体挑选合适的抒发环境【PET/PGEX:15℃抒发留宿;25℃抒发6h;37℃抒发3h至4h(4支试管,“0”“1”号试管15℃抒发留宿;“2”“3”试管37℃抒发3h至4h)。Pcold:【全数15℃抒发留宿】

3. 抒发判定第三天,全菌的抒发判定阐发,注重节制溶质的量及溶液黏度

  • 从每组4支的试管中均取500μL菌液插手到1.5ml离心管中,【若OD值不一样,值小的可多取】离心(6000r/min),5min, 去上清,留积淀【积淀少的,可再取菌液离心,尽可能使积淀量靠近】
  • 在每一个离心管中插手500μL的DDH2O,悬浮积淀,离心(6000r/min),5min, 去上清,留积淀
  • 在每支离心管中插手45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮积淀【当溶质适当且均一的环境下,插手量稳定;当溶质多且黏稠时,应使插手量增大,为下降粘度也可削减上液量】
  • 放入煮样器(100℃) 25min
  • 掏出后离心(6000r/min)  3min,  电泳检测。
  • 卵白抒发量不错,停止卵白纯化;卵白抒发量低或没抒发,可参考原核抒发FAQ绝对应处理计划处理。

4. 卵白纯化:见卵白纯化专题

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