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凝胶过滤色谱

择要:本文首要讲授了凝胶过滤色谱法(份子筛)在卵白纯化尝试中的利用,包含纯化道理、尝试计划设想、手艺操纵和相干案例先容和题目阐发。
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根基道理

凝胶过滤色谱卵白纯化法,又称为空间排阻色谱,份子筛等。其道理是利用卵白质份子量或份子外形的差别来分手。当样品从色谱柱的顶端向下活动时,大的卵白质份子不能进入凝胶颗粒从而被敏捷洗脱;而较小的卵白质份子能够或许或许进入凝胶颗粒中,且进入凝胶的卵白在凝胶中保留时候也差别,份子量越大,流出时候就越早,终究分手份子巨细差别的卵白质。

凝胶过滤色谱

凡是,大都凝胶基质是化学交联的聚合物份子制备的,交联水平决议凝胶颗粒的孔径。经常利用的色谱基质有:葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)、聚丙烯酰氨凝胶(Bio-Gel P)等。高度交联的基质可用来分手卵白质和其余份子量更小的份子,或是撤除低份子量缓冲液成份和盐,而较大孔径的凝胶可用于卵白质份子之间的分手。选用适合孔径的凝胶很大水平取决于方针卵白的份子量和杂卵白的份子量。

尝试计划设想

  1. 凝胶介质的挑选
    凝胶介质的挑选首要是按照待分手的卵白和杂卵白的份子量挑选具备响应分手规模的凝胶,同时还须要斟酌到分辩率和不变性的身分。比方,若是是要将目标卵白和小份子物资分隔,能够或许按照他们分派系数的差别,选用Sephadex G-25和 G-50;对小肽和低份子量物资的脱盐,则能够或许选用Sephadex G-10、G-15和Bio-Gel P-2或P-4;若是是份子量附近的卵白质,普通选用排阻限度略大于样品中最高份子量物资的凝胶。详细凝胶过滤色谱介质利用以下:

    经常利用凝胶过滤色谱介质的分手规模
    凝胶介质 卵白质的分手规模/103 凝胶介质 卵白质的分手规模/103
    Sephadex G25
    Sephadex G50
    Sephadex G100
    Sephadex G200
    Sepharose 6B
    Sepharose 4B
    1~5
    1.5~30
    4~150
    5~600
    10~4000
    60~20000
    Sepharose 2B
    Bio-Gel P-4
    Bio-Gel P-10
    Bio-Gel P-60
    Bio-Gel P-150
    Bio-Gel P-300
    70~40000
    0.5~4
    5~17
    30~70
    50~150
    100~400
  2. 凝胶介质的预处置
    凝胶在利用前利用水充实溶胀(胶:水=1:10),天然溶胀的耗时较长,可接纳加热的方式使溶胀加快,即在滚水浴中将凝胶升温至沸,1~2h便可到达溶胀。在烧杯中将枯燥凝胶加水或缓冲液,搅拌,静置,倾去下层混悬液,撤除上清液中的凝胶碎块,反复数次,直到上清廓清为止。
  3. 色谱柱的挑选
    色谱柱的体积和高径比与色谱分手结果紧密亲密相干,凝胶柱床的体积、柱长和柱的直径和柱比的挑选必须按照样品的数目,性子和分手目标停止肯定。组别分手时,大多接纳2~30cm长的色谱柱,柱床体积为样品溶液体积的5倍以上,柱比普通在5~10之间;而分级分手普通须要100cm摆布的色谱柱,并请求柱床体积大于样品体积25倍以上,柱比在20~100之间。
  4. 凝胶柱的填装
    凝胶色谱柱与别的色谱方式差别,溶质份子与牢固相之间不力的感化,样品组分的分手完整依靠于他们各自的流速差别。装住时关住柱子下口,在柱内插手约1/3柱床体积的水或缓冲液,而后沿着柱子一侧将缓冲液中的凝胶搅拌平均,迟缓并持续的一次性注入柱内。待凝胶堆积约5厘米摆布时,翻开柱子下口,节制流速在1ml/min。
  5. 样品的处置与上样
    按照样品的范例和纯化阐发,须要挑选适合的缓冲液,为了到达杰出的阐发结果,上样量必须坚持在较小的体积,普通为柱床体积的1%~5%,卵白质样品上样前应停止稀释,使样品浓度不大于4%(样品浓度与分派系数有关),但须要注重的是,较大份子量的物资,溶液粘度会随浓度增添而增大,使份子活动受限,影响流速。上样前,样品要经滤膜过滤或离心,撤除能够或许梗塞色谱柱的杂质。
  6. 洗脱与搜集
    凝胶过滤色谱的缓冲液用单一缓冲液或含盐缓冲液作为洗脱液便可,首要斟酌俩个方面的缘由:卵白的消融性和不变性。所用的缓冲液要保障卵白质样品在此中不会变性或积淀,PH应选在样品较不变、消融性杰出的规模以内,同时缓冲液中要含有必然的盐(NaCL),对卵白质起不变和掩护感化。洗脱进程中一直坚持必然的操纵压,流速不可太高,坚持在0.5~3.0mL/min便可。

案列先容

AKTA凝胶过滤色谱分手卵白质

材料

色谱介质:Sephacryl S-200,卵白质分手规模(5~250)×103

色谱柱:XK16/60预装柱
色谱装备:AKTA Explorer
夹杂样品:含单克隆抗体,份子量180000;牛血清白卵白(68000),溶菌酶(14000)
NaOH 0.5 mol/L
NaCl 200 mmol/L
PB 20 mmol/L
PH7.0 缓冲液

方式

  1. 凝胶除菌处置:超纯水冲刷柱子后,用0.5mol/L NaOH正向冲刷柱,流速3mL/min,冲刷3柱体积
  2. 均衡:NaOH处置终了后,用超纯水冲刷2柱体积,接着用含200mmol/L NaCl和20mmol/L PB的7.0PH缓冲液冲刷5~10倍柱体积
  3. 上样:均衡终了后,挑选样品泵停止上样,上样流速3mL/min,上样体积为1mL
  4. 洗脱:上样竣事后,用均衡缓冲液停止洗脱
  5. 洗濯与保管

纯化竣事后,用0.5mol/L NaOH反向冲刷2柱体积,冲刷时候30~60min,冲刷竣事后,用超纯水正向冲刷5柱体积,再用20%乙醇冲刷3柱体积,而后拆下柱子,两头封死,高温保管。

题目阐发和处理计划

  1. 色谱分手前若何污染样品
  2. 在色谱分手前,对样品停止离心和过滤,离心能撤除大局部块状物,若是离心后样品仍不清亮,可用滤膜过滤。由醋酸纤维薄膜或PVDF材料制成的滤膜能够或许或许非特同性的连系少许卵白。

  3. 溶液互换不完全
  4. 严酷节制上样体积,上样体积不跨越柱体积30%。
    若样品溶液体积较多,能够或许分屡次上样,注重每次上样时候距离,可按照电导色谱峰肯定下一次上样时候。

  5. 分辩率不高
  6. 1)进步装柱品质,使色谱柱装填匀实;

    2)进步柱床高度;

    3)节制上样体积,最大上样体积不跨越柱床体积5%;

    4)节制样品黏度与洗脱溶液黏度坚持分歧;

    5)按照样品特色挑选适合的洗脱溶液,调理洗脱溶液的离子强度或亲水性;

    6)挑选适合的凝胶柱(若何挑选请参照上文)

  7. 色谱峰对称性差
  8. 1)进步装柱品质,装柱匀实——若柱装的太松,轻易引发拖尾,装的太紧,会引发前沿;
    2)柱较脏,再生色谱柱

  9. 肩峰呈现的缘由及处理方式

1)柱床松动,从头装柱或反向冲刷柱
2)柱筛板梗塞,超声洗濯筛板
3)柱干裂,从头装柱

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