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多聚组氨酸标签(His-tag)先容及亲和层析道理

相干材料:His标签亲和纯化尝试步骤(具体)

本文描写了多聚组氨酸标签(His-Tag)融会卵白操纵Ni-IDA/Ni-NTA停止亲和层析的根基道理,上风,和尝试操纵流程。

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牢固化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),简称金属螯合亲合层析,是一种新型的操纵于原核卵白纯化的手艺。该方式经由过程卵白质外表的一些特别的氨基酸,使之与金属离子产生彼此感化,从而对卵白质停止亲和纯化。这些感化包含配价键连系、静电吸附、共价键连系等,此中以6个组氨酸残基组合的融会标签(His-Tag)在原核卵白抒发中的操纵最为明显。

His-Tag可连系在方针卵白的C结尾或N结尾,构成特别的布局,以便于停止下一步的纯化及检测。因为金属螯合亲合层析具备配体简略、吸附量大、分手前提暖和、通用性强等特色,以是可挑选规模广,高盐,存在变性剂和去垢剂的上样前提下停止纯化,His-Tag正逐步成为分手纯化卵白质等生物工程产物最有用的手艺之一。

His-tag作为卵白纯化时的首选标签,其上风在于:

  1. N-真个His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有益于卵白抒发;
  2. 接纳IMAC(牢固化金属离子亲合层析)纯化His-Tag融会卵白操纵加倍简洁;
  3. His-Tag对方针卵白自身特征几近不影响,不会转变方针卵白自身的可溶性和生物学功效;
  4. His-Tag很是小,在融会卵白结晶后对卵白的布局不影响;His-Tag的免疫原性绝对较低,可将纯化的卵白间接打针入植物体内停止免疫并制备抗体;
  5. 与别的亲和标签构建成双亲和标签,并可操纵于多种抒发体系;

His-Tag融会卵白的合用规模也较广,既能够在非离子型外表活性剂存在的前提下纯化,也能够在变性前提下停止纯化。前者凡是用来纯化疏水性强的方针卵白,而后者则凡是纯化包涵体卵白。

His-Tag亲和层析填料

His-Tag可与多种金属离子产生特别的彼此感化,如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其道理是操纵卵白质外表的特征,使之被吸附在凝胶柱上,从而到达分手纯化卵白的方针。

Ni2+在亲和纯化尝试中的操纵最为遍及。按照连系基团的差别,Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位,此中Ni-IDA螯合了三价,Ni-NTA螯合了四价。以是IDA的载量要比NTA的高,在一样前提下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的连系力使金属离子在洗脱阶段时很轻易浸出,与方针卵白慎密连系,从而致使分手卵白产量偏低,产物不纯及金属离子净化等题目。而NTA的颗粒粒度平均,粒径更小,并且螯合镍更不变,能耐受较高的复原剂,使填料加倍不变,镍离子不易零落。

Ni-IDA和Ni-NTA布局图

IMAC在凡是的情况下是比拟不变的,但螯合剂的存在则会致使其金属离子零落。比方在E.coli的裂解液中遍及存在一些非特异的弱螯合剂,如在三羧酸轮回中产生了二羧酸类物资。是以,E.coli在某些高压情况下就会产生高特同性的金属螯合剂(凡是存在于细菌的细胞周质中),致使His-Tag融会卵白纯化的纯度和产量大大下降。以是在停止纯化His-Tag融会卵白的尝试时,起首须要去除螯合剂。

Ni-NTA亲和层析尝试

Ni-NTA分手带His标签的重组卵白

  1. Ni-NTA装柱,1.6×20cm,柱床体积为10ml;
  2. 用缓冲液1均衡2~5个床体积,流速为2ml/min;
  3. 将20ml细胞破裂液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45um滤膜过滤,上样,流速为1ml/min;
  4. 用缓冲液1再洗2~5个床体积,流速为2ml/min;
  5. 用别离含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3停止阶段洗脱,流速为2ml/min,搜集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融会卵白的份子量巨细和纯度;
  6. 用纯水流洗5个柱床体积,再用20%的乙醇流洗3个柱床体积,流速为2ml/min,柱子置于高温情况中保管。

缓冲液构成:

缓冲液1

50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g,
加适当水消融后定容到1000ml。

缓冲液2

50mM磷酸盐缓冲液,pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19ml,0.5M Na2HPO4 81ml,NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适当,水调pH后定容到1000ml。

缓冲液3

差别咪唑浓度的缓冲液B配制:

咪唑浓度 缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml)
10mM 98 2
50mM 90 10
100mM 80 20
200mM 60 40
300mM 40 60
400mM 20 80

咪唑洗脱道理

Ni柱中的氯化镍能够与有His-Tag的融会卵白连系,也能够与咪唑停止连系,当标签卵白与层析柱外表珠孔内的
镍离子介质产生连系时,差别浓度的咪唑经由过程层析柱,就会将与镍配位的标签卵白,杂卵白等别离洗脱上去,从而获得高纯度方针卵白。

附录:Ni-IDA和Ni-NTA的一些参数对照

称号 Ni-IDA Ni-NTA
参数 目标
基质 6%交联琼脂糖凝胶
配基 亚胺二乙酸(IDA) 次氮基三乙酸(NTA)
粒径 45~165 µm 60~169 µm
金属离子密度 40 µmol/ml 20-40 µmol/ml
载量 25-30mg卵白/ml 15mg卵白/ml
柱体积 1ml或5ml 1ml或5ml
柱尺寸
(内径x高度)
0.9×1.57cm(1ml柱子)
0.9×1.57cm(5ml柱子)
0.6cmx2.8cm(1ml柱子)
1.4cmx2.98cm(5ml柱子)
保举流速 1ml/min(1ml柱子)
5ml/min(5ml柱子)
最高流速 4ml/min(1ml柱子)
10ml/min(1ml柱子)
20ml/min(5ml柱子)
40ml/min(5ml柱子)
最高耐压 0.3MPa(3bar) 0.5MPa(5bar)
防止操纵的试剂 螯合剂:EDTA、EGTA、柠檬酸等 >20mM硫化试剂
>10mM DTT
螯合剂:EDTA、EGTA
阴离子去污剂
pH不变性 PH 2-14(短时间,2h);PH 3-12(持久,7天)
仅供科研

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