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离子互换色谱的道理先容和现实操纵

择要:本文首要从根本道理与尝试设想思绪两个方面报告了卵白纯化尝试中离子互换色谱的利用,并附有AKTA离子互换色谱操纵案例。

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根基道理

离子互换色谱是卵白纯化手艺中经常利用的一种纯化方式,其道理是指被分手物资所带的电荷可与离子互换剂所带的相反电荷连系,这类带电份子与牢固相之间的连系感化是可逆的,在转变pH或用逐步增添离子强度的缓冲液洗脱时,离子互换剂上连系的物资可与洗脱液中的离子产生互换而被洗脱到溶液中。因为差别物资的电荷差别,其与离子互换剂的连系才能也差别,以是被洗脱到溶液中的挨次也差别,从而被分手出来。

离子互换色谱纯化道理

离子互换剂是由不溶于水的网状布局高份子聚合物骨架组成,骨架上有很多共价连系的带电基团,若是侧链是带正电基团,便可与带负离子相连系,称为阴离子互换剂,吸附带负电卵白质。若是侧链是带负电的基团,则称为阳离子互换剂。强离子互换树脂在宽pH规模内坚持离子化,而弱离子互换树脂只在窄pH值内离子化。

范例 称号 英文标记
阴离子互换剂 二乙基氨乙基
季氨基乙基
季氨基
三乙基氨乙基
氨乙基
DEAE
QAE
Q
TEAE
AE
阳离子互换剂 羧甲基
磺丙基
磺甲基
磷酸基
CM
SP
S
P

绝大大都重组卵白纯化都要用到离子互换。离子互换色谱的根本是高分辩率,能够间接放大规模利用在产业上,柱再生轻易,还能够使卵白浓缩。大大都卵白质的静电荷是负值,是以阴离子互换色谱的利用最为普遍。

尝试设想

介质的挑选

离子互换介质起首要斟酌方针份子的巨细,因为方针份子会影响其靠近介质上的带电功效团体,是以也会影响介质对方针份子的能源载量,从而影响其分手。

对大大都纯化步骤来讲,倡议从起头的阶段利用强离子互换柱,可在试探方式的进程中有一个宽的pH规模。对已知等电点的卵白质,可按照其等电点来挑选。而未知等电点的卵白质,在现实操纵中常接纳如许的方式,先挑选一个阴离子互换剂,再挑选一个中性的pH缓冲液,将卵白质样品透析至pH7.0,而后过阴离子互换柱。按照过柱后的成果肯定下一个利用的缓冲液pH。

活动相的挑选

离子互换色谱的活动相必需是有必然离子强度的并对pH有必然缓冲才能的溶液。为了防止方针卵白失活,利用缓冲液可不变活动相的pH,使之在色谱进程中不产生较着变更,同时可不变方针份子上的电荷量,保障色谱成果的主要性。

挑选缓冲液普通按照以下准绳:阳离子互换剂应选用阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸盐等;阴离子互换剂应选用阳离子缓冲液,可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等;肇端缓冲液的浓度应尽能够低(<100mmol/L)如许能够使色谱柱上更多的吸附分手物资;缓冲液应不含会影响被分手物资活性和消融度成份,洗脱时尽能够不接纳pH梯度洗脱。

色谱柱的挑选

离子互换色谱凡是选用粗短柱,即高径比小的色谱柱。典范的离子互换柱高度在5~20cm,高径比普通小于5。若是须要增添离子互换剂的体积,只能从增添柱的直径而不能增添其高度。若是是持续梯度洗脱,能够恰当增添柱的长度。

案例先容(AKTA Pilot)体系

离子互换是卵白纯化中的主要手腕,即能够用于捕获阶段,也能够用于精纯阶段。

预处置和装柱

  1. 将超纯水与沉降胶按1:3比例悬浮,悄悄搅匀;
  2. 将色谱柱牢固到装备支架上,链接出口管道,从柱底端入口反向泵入超纯水,解除管道及筛板中的气泡,停泵,而后从出口端放出局部超纯水,保留1~2cm高度超纯水,封死出口端,而后正向冲刷入口端管道和适配器,解除筛板和管道中气泡;
  3. 经由过程玻璃棒引流将悬浮胶导入色谱柱,在柱上端补充局部超纯水,搅匀,装上适配器;
  4. 将柱出口端与色谱装备毗连,以0.2MPa恒压装柱,装填至恒定的柱床高度,标记柱床胶面地位,封闭泵,松开适配器,降落适配器至胶面下2mm处,持续装填,待柱床高度不变后,标记柱床胶面地位,降落适配器至柱上标记柱床地位下2mm。牢固适配器,持续装填2~3柱体积;
  5. 肯定柱体积,丈量柱高,计较柱体积及记实装柱时的最大流速;
  6. 挑选最好线速,用0.5mol/L NaOH冲刷柱,冲刷3~5体积;
  7. 接着用超纯水冲柱,冲刷10柱体积,至pH显现靠近超纯水pH。

柱的均衡

20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH6.5,用10柱体积均衡缓冲液均衡柱子,直至pH及电导率监控显现与均衡缓冲液的pH及电导分歧。

加样

按照柱体积及装柱的最大流速肯定上样流速,上样流速不跨越装柱最大流速的75%,同时,上样流速也要尽能够低,保障样品和介质充实产生感化。

洗脱

上样竣事后,用均衡缓冲液冲刷1~2柱体积,使UV280呼应旌旗灯号从头回到基线。

以后用含有0.5mol/L NaCL的溶液洗脱,冲刷2~3柱体积,搜集色谱峰。

罕见题目阐发

  1. 纯化后样品纯度不高怎样办?
    • 若方针卵白和杂卵白等电点差别较大,方针卵白经由过程穿透步骤取得,经由过程调理肇端缓冲液pH,使方针卵白与填料之间的静电感化更强;
    • 若方针卵白和杂卵白等电点差别较小,方针卵白经由过程洗脱步骤取得,过调理肇端缓冲液pH,使方针卵白与填料之间的静电感化更强;再调理洗脱溶液的离子强度和pH,使方针卵白与杂卵白逐步分手;
    • 挑选适合的离子互换填料及粒径;
    • 柱不颠末肇端缓冲液的充实均衡;
    • 降落洗脱流速;
    • 调剂样品溶液黏度。
  2. 纯化后的卵白收率较低怎样办?
    • 调剂样品pH,使样品pH与肇端缓冲液pH坚持分歧;
    • 转变洗脱形式,如将线性梯度形式转变为阶段性梯度洗脱;
    • 转变洗脱方式,如将pH洗脱方式改成盐梯度洗脱方式;
    • 转变洗脱强度。
  3. 样品过于黏稠怎样处置?
    • 样品过于黏稠能够是因为含有的卵白太多,或含有大份子量的核酸份子,凡是有以下处理方式:
    • 增添裂解前浓缩细胞所用体积;
    • 增添裂解时候,直至黏度降落,或增添DNase和Mg2+的剂量;
    • 增添机器裂解细胞的效力;
    • 降落上样流速。
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