离子互换色谱是卵白纯化手艺中经常利用的一种纯化方式,其道理是指被分手物资所带的电荷可与离子互换剂所带的相反电荷连系,这类带电份子与牢固相之间的连系感化是可逆的,在转变pH或用逐步增添离子强度的缓冲液洗脱时,离子互换剂上连系的物资可与洗脱液中的离子产生互换而被洗脱到溶液中。因为差别物资的电荷差别,其与离子互换剂的连系才能也差别,以是被洗脱到溶液中的挨次也差别,从而被分手出来。
离子互换剂是由不溶于水的网状布局高份子聚合物骨架组成,骨架上有很多共价连系的带电基团,若是侧链是带正电基团,便可与带负离子相连系,称为阴离子互换剂,吸附带负电卵白质。若是侧链是带负电的基团,则称为阳离子互换剂。强离子互换树脂在宽pH规模内坚持离子化,而弱离子互换树脂只在窄pH值内离子化。
范例 | 称号 | 英文标记 |
---|---|---|
阴离子互换剂 | 二乙基氨乙基 季氨基乙基 季氨基 三乙基氨乙基 氨乙基 |
DEAE QAE Q TEAE AE |
阳离子互换剂 | 羧甲基 磺丙基 磺甲基 磷酸基 |
CM SP S P |
绝大大都重组卵白纯化都要用到离子互换。离子互换色谱的根本是高分辩率,能够间接放大规模利用在产业上,柱再生轻易,还能够使卵白浓缩。大大都卵白质的静电荷是负值,是以阴离子互换色谱的利用最为普遍。
离子互换介质起首要斟酌方针份子的巨细,因为方针份子会影响其靠近介质上的带电功效团体,是以也会影响介质对方针份子的能源载量,从而影响其分手。
对大大都纯化步骤来讲,倡议从起头的阶段利用强离子互换柱,可在试探方式的进程中有一个宽的pH规模。对已知等电点的卵白质,可按照其等电点来挑选。而未知等电点的卵白质,在现实操纵中常接纳如许的方式,先挑选一个阴离子互换剂,再挑选一个中性的pH缓冲液,将卵白质样品透析至pH7.0,而后过阴离子互换柱。按照过柱后的成果肯定下一个利用的缓冲液pH。
离子互换色谱的活动相必需是有必然离子强度的并对pH有必然缓冲才能的溶液。为了防止方针卵白失活,利用缓冲液可不变活动相的pH,使之在色谱进程中不产生较着变更,同时可不变方针份子上的电荷量,保障色谱成果的主要性。
挑选缓冲液普通按照以下准绳:阳离子互换剂应选用阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、甘氨酸盐等;阴离子互换剂应选用阳离子缓冲液,可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等;肇端缓冲液的浓度应尽能够低(<100mmol/L)如许能够使色谱柱上更多的吸附分手物资;缓冲液应不含会影响被分手物资活性和消融度成份,洗脱时尽能够不接纳pH梯度洗脱。
离子互换色谱凡是选用粗短柱,即高径比小的色谱柱。典范的离子互换柱高度在5~20cm,高径比普通小于5。若是须要增添离子互换剂的体积,只能从增添柱的直径而不能增添其高度。若是是持续梯度洗脱,能够恰当增添柱的长度。
离子互换是卵白纯化中的主要手腕,即能够用于捕获阶段,也能够用于精纯阶段。
20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH6.5,用10柱体积均衡缓冲液均衡柱子,直至pH及电导率监控显现与均衡缓冲液的pH及电导分歧。
加样
按照柱体积及装柱的最大流速肯定上样流速,上样流速不跨越装柱最大流速的75%,同时,上样流速也要尽能够低,保障样品和介质充实产生感化。
洗脱
上样竣事后,用均衡缓冲液冲刷1~2柱体积,使UV280呼应旌旗灯号从头回到基线。
以后用含有0.5mol/L NaCL的溶液洗脱,冲刷2~3柱体积,搜集色谱峰。