1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培育基
2、37℃振荡培育留宿
3、取100ul菌体于2mlEp管中,4000rpm离心3min,弃上清
4、加100ul溶液A(1%葡萄糖50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充实夹杂
5、插手200ul溶液 B(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),悄悄翻转混匀,置于冰浴5 min
6、插手150ul预冷溶液C(5 mol/L KAc,pH4.8),悄悄翻转混匀,置于冰浴5 min
7、10000rpm离心20min,取上清
8、插手等体积的异戊醇,混匀后于60℃静置10min
9、再次10000rpm离心20min,弃上清
10、用500ul70%的乙醇洗濯,抽干一切液体
11、待积淀枯燥,溶于5ul的TE缓冲液中(凡是可取得3-5ug的DNA)
真核细胞DNA的提取是停止功效和布局研讨的主要一步,真核DNA提取要保障DNA的完全性(不断裂)。真核DNA能够或许从培育的细胞新颖的构造中提取。凡是都是接纳卵白酶消化后用酚抽提取得。差别来历的材料停止差别的预处置,可是后续提取DNA的方式是近似的,提取的准绳便是,尽可能削减对DNA的粉碎或降解,坚持其完全性。详细提取步骤以下:
(一)材料预处置:
培育细胞用缓冲液洗濯后离心(4000rpm/5min)去除上清,取得细胞积淀物插手10倍体积的裂解缓冲液,55℃水浴1-2小时;
构造(构造要剪碎匀浆)插手1.5ml到离心管中,插手20%的SDS 25ul,卵白酶K(2mg/ml)25ul,而后混匀,60℃水浴1-3小时;
(二)DNA的提取(合用于处置后的细胞或构造)
提取DNA的物品须要高压灭菌,以避免带入其余核酸净化;试剂一样高压灭菌;
PCR扩增尝试步骤详见:PCR规范操纵流程。
琼脂糖凝胶电泳,因此琼脂糖为介质,对差别巨细的DNA或RNA完成分手的一种电泳方式。琼脂糖是一种多糖,具备亲水性,可是不带电荷。使得DNA在碱性前提下使其带负电荷(pH8.0的缓冲液),在电流感化下,以琼脂糖凝胶为介质,由负极向正极挪动,按照差别的DNA份子片断的巨细和外形差别,在电场中泳动的速度也不不异,同时在样品中插手染料(如EB或花青素类染料)能够或许和DNA份子间构成络合物,颠末紫外照耀,能够或许看到DNA的地位(比对marker可知份子量巨细),从而到达分手、判定的目标。如图1为琼脂糖凝胶电泳道理。
图1:琼脂糖凝胶电泳道理
图2:琼脂糖凝胶电泳仪器
琼脂糖凝胶配制浓度与DNA的最好分手规模
琼脂糖浓度/% | 0.3 | 0.6 | 0.7 | 0.9 | 1.2 | 1.5 | 2.0 |
DNA巨细/kb | 5-60 | 1-20 | 0.8-10 | 0.5-7 | 0.4-6 | 0.2-4 | 0.1-3 |
(一)50 x TAE buffer(pH8.5)
在1L烧杯中精确称取Tris 242g,EDTA(Na)37.2g,插手800ml的去离子水,充实搅拌消融,插手57.1ml的乙酸,充实搅拌,调pH8.5后,定容至1L。每次利用加水浓缩50倍即1xTAE buffer。
(二)10 x TBE buffer(pH8.3)
在1L烧杯中精确称取Tris 108g,EDTA 7.44g,硼酸55g,插手800ml的去离子水,充实搅拌,调pH8.3后,定容至1L。
(三)6 x loading buffer
在500ml烧杯中,精确称取EDTA 4.4g,二甲苯青FF250mg、溴酚蓝(Bromophenol Blue)250mg,插手200ml去离子水,加热至充实消融;在插手180ml甘油,条pH为7.0,用去离子水定容至500ml,常温保管。
对一些电泳竣事的DNA停止收受接管,用于亚克隆或探针标记。经常利用的方式有低熔点琼脂糖法,压碎法。或利用今朝较为便利的试剂盒收受接管。上面先容冻融法收受接管DNA片断。