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琼脂糖凝胶电泳道理/尝试步骤/特色/相干FAQ

本文首要先容了琼脂糖凝胶电泳的道理及尝试操纵步骤,及电泳后DNA的收受接管方式;琼脂糖凝胶的特色及电泳尝试相干试剂的设置装备摆设及琼脂糖凝胶电泳罕见题目阐发。
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琼脂糖凝胶电泳样品制备

大肠杆菌质粒DNA模板提取:

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培育基

2、37℃振荡培育留宿

3、取100ul菌体于2mlEp管中,4000rpm离心3min,弃上清

4、加100ul溶液A(1%葡萄糖50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充实夹杂

5、插手200ul溶液 B(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),悄悄翻转混匀,置于冰浴5 min

6、插手150ul预冷溶液C(5 mol/L KAc,pH4.8),悄悄翻转混匀,置于冰浴5 min

7、10000rpm离心20min,取上清

8、插手等体积的异戊醇,混匀后于60℃静置10min

9、再次10000rpm离心20min,弃上清

10、用500ul70%的乙醇洗濯,抽干一切液体

11、待积淀枯燥,溶于5ul的TE缓冲液中(凡是可取得3-5ug的DNA)

真核细胞DNA模板提取:

真核细胞DNA的提取是停止功效和布局研讨的主要一步,真核DNA提取要保障DNA的完全性(不断裂)。真核DNA能够或许从培育的细胞新颖的构造中提取。凡是都是接纳卵白酶消化后用酚抽提取得。差别来历的材料停止差别的预处置,可是后续提取DNA的方式是近似的,提取的准绳便是,尽可能削减对DNA的粉碎或降解,坚持其完全性。详细提取步骤以下:

(一)材料预处置:

培育细胞用缓冲液洗濯后离心(4000rpm/5min)去除上清,取得细胞积淀物插手10倍体积的裂解缓冲液,55℃水浴1-2小时;

构造(构造要剪碎匀浆)插手1.5ml到离心管中,插手20%的SDS 25ul,卵白酶K(2mg/ml)25ul,而后混匀,60℃水浴1-3小时;

(二)DNA的提取(合用于处置后的细胞或构造)

  1. 预处置的样品插手饱和酚,悄悄混匀几分钟后离心(5000rpm/10min),去下层水相;
  2. 插手等体积的饱和酚,混匀,再次离心,去下层水相;直至去下层水相变得廓清,不然可反复此操纵;
  3. 插手非常之一的3M错酸钠(pH2.5)HE 2.5倍体积的无水乙醇,悄悄混匀;
  4. 呈现絮状物后离心(5000rpm/10min),弃上清;用75%乙醇洗濯积淀,再次离心,弃上清;
  5. 室温下晾干(待乙醇挥发),插手100ul TE消融便可。

提取DNA的物品须要高压灭菌,以避免带入其余核酸净化;试剂一样高压灭菌;

PCR扩增

PCR扩增尝试步骤详见:PCR规范操纵流程

琼脂糖凝胶电泳道理

琼脂糖凝胶电泳,因此琼脂糖为介质,对差别巨细的DNA或RNA完成分手的一种电泳方式。琼脂糖是一种多糖,具备亲水性,可是不带电荷。使得DNA在碱性前提下使其带负电荷(pH8.0的缓冲液),在电流感化下,以琼脂糖凝胶为介质,由负极向正极挪动,按照差别的DNA份子片断的巨细和外形差别,在电场中泳动的速度也不不异,同时在样品中插手染料(如EB或花青素类染料)能够或许和DNA份子间构成络合物,颠末紫外照耀,能够或许看到DNA的地位(比对marker可知份子量巨细),从而到达分手、判定的目标。如图1为琼脂糖凝胶电泳道理。琼脂糖凝胶电泳道理

图1:琼脂糖凝胶电泳道理

琼脂糖凝胶电泳长处

  1. 琼脂糖凝胶是具备大批细小孔道的基质,其孔径尺寸取决于它的浓度。0.075琼脂糖的孔径为800nm,0.16的孔径为500nm,1%的琼脂糖孔径为150nm,这都是经常利用的琼脂糖凝胶的浓度,能够或许分手0.1-60kb摆布的DNA,大孔性有益于免疫牢固、免疫电泳和微量制备;
  2. 琼脂糖具备较高机器强度,许可在1%或更低的浓度下利用;且与别的生物只存在微小的连系;
  3. 琼脂糖无毒,琼脂糖胶凝结进程不会产生自在基聚合,无需催化剂;
  4. 琼脂糖胶具备热可逆性,低熔点易于收受接管样品,可用于对温度敏感材料的制备;
  5. 易于保管,是高活络喷射自显影的抱负材料。

琼脂糖凝胶电泳步骤

琼脂糖凝胶电泳仪器

图2:琼脂糖凝胶电泳仪器

  1. 用蒸馏水将制胶东西洗清洁,筹办好制胶平板,用琼脂将模具边缘封锁,架好梳子;
  2. 按照要分手的样品(DNA)巨细配制适合浓度的琼脂糖凝胶。精确的称取必然量的琼脂糖干粉,插手到适合体积的锥形瓶中,插手必然量的电泳缓冲液(30ml摆布TAE);放入到微波炉内加热熔化,冷却半晌(不烫手便可);
  3. 熔化后的琼脂溶液摇摆混匀,倒入电泳槽中,等其凝结;
  4. 室温下凝结30-40min摆布,谨慎的拔出梳子,掏出凝结好的凝胶放入电泳槽内,筹办上样;
  5. 在电泳槽中倒入电泳缓冲液(TAE);没过胶面1mm摆布,去除胶孔内的气泡;
  6. 上样,5ulDNA样品插手1ul上样缓冲液(loading buffer)和1ul的染料,用抢混匀后插手到凝胶孔内;
  7. 上样竣事,接通电源,白色正极,玄色负极,DNA样品有负极往正极活动,加样孔侧为负,,40-50v电压,电压30敏摆布便可(<40min);
  8. 电压竣事,封闭电源,凝胶成像仪上察看电压地位并比对marker判定巨细。

琼脂糖凝胶配制浓度与DNA的最好分手规模

琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA巨细/kb 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3

琼脂糖凝胶电泳相干试剂设置装备摆设

(一)50 x TAE buffer(pH8.5)
在1L烧杯中精确称取Tris 242g,EDTA(Na)37.2g,插手800ml的去离子水,充实搅拌消融,插手57.1ml的乙酸,充实搅拌,调pH8.5后,定容至1L。每次利用加水浓缩50倍即1xTAE buffer。
(二)10 x TBE buffer(pH8.3)
在1L烧杯中精确称取Tris 108g,EDTA 7.44g,硼酸55g,插手800ml的去离子水,充实搅拌,调pH8.3后,定容至1L。
(三)6 x loading buffer
在500ml烧杯中,精确称取EDTA 4.4g,二甲苯青FF250mg、溴酚蓝(Bromophenol Blue)250mg,插手200ml去离子水,加热至充实消融;在插手180ml甘油,条pH为7.0,用去离子水定容至500ml,常温保管。

琼脂糖凝胶电泳竣事DNA的收受接管

对一些电泳竣事的DNA停止收受接管,用于亚克隆或探针标记。经常利用的方式有低熔点琼脂糖法,压碎法。或利用今朝较为便利的试剂盒收受接管。上面先容冻融法收受接管DNA片断。

  1. 切胶(无核酸净化的清洁刀片切):电泳竣事后,切下对应片断巨细的琼脂糖凝胶,置于1.5ml的离心管中;
  2. 插手等体积的Tris-HCl饱和酚(pH7.6),振荡混匀,在-20℃安排10min;
  3. 高温离心(10000rpm/5min),将离心下层转移至新的离心管中;
  4. 在含胶的离心管中插手一半体积的水,振荡混匀,在-20℃安排10min;
  5. 高温离心(10000rpm/5min),归并上清液;
  6. 用等体积的酚和氯仿别离抽提一次,取得上清;插手非常之一体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀;在-20℃安排30min;
  7. 高温离心(13000rpm/10min),弃上清,75%乙醇洗积淀2次,待乙醇挥发后插手水或TE消融便可。

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